آزمایشگاه میکروبیولوژی

پارامتر های آزمایشگاه میکروبیولوژی

ردیف

parameter

پارامتر

واحد اندازه گیری

1

T-Coli

توتال کلیفرم

MNP/100cc

2

F-Coli

فکال کلیفرم

MNP/100cc

 

 

 

 

 

کلیفرم ها

منظور از کلیفرمها باسیلهای گرم منفی، بدون اسپور، هوازی و هوازی اختیاری است که قادر به تخمیر قند لاکتور و تولید اسید و گاز در دمای 35 الی 37 درجه می باشند.

کلیفرمهای گوارشی: آندسته از کلیفرمها هستند که در روده بزرگ انسان و حیوانات خون گرم هستتند وقادر به تخمیر قند لاکتوز تولید اسید و گاز در دمای 44 تا 43 درجه سلسیوس نیز می باشند.

وجود این باکتریها در آب نشاندهنده نا کافی بتودن فرآیند تصفیه و همچنین آلودگی متناوب آب با مدفوع انسان و حیوان است. 

تجهیزات

انکوباتور، بن ماری، آون،  اتوکلاو ، هود لامینار، ترازو                 

آزمون برای شمارش کلیفرمها با روش تخمین محتمل ترین تعداد (M.P.N)

روش بر اساس نظریه احتمالات بوده و فرض بر این است که میکروارگانیسم با یک توزیع یکنواخت درنمونه پخش شده اند. پس از تلقیح حجم های مختلف نمونه به لوله های حاوی محیط مایع و گرمخانه گذاری، تغییرات ویژه ای ناشی از رشد باکتریها مانند کدورت، تولید گاز، تغییر pH ظاهر خواهد شد. با در نظر گرفتن تعداد لوله های مثبت از نظر تولید گاز در لوله های دورهام و با استفاده از جدول آماری می توان بیشترین تعداد احتمالی باکتری را تخمین زد.

محیط کشت

 برای آماده سازی محیط های کشت دستورالعمل سازنده در آزمایشگاه محیط زیست باید به طور دقیق رعایت شود. بسیاری از محیط های کشت را می توان پس از سترون شدن به صورت کاملا در بسته در دمای 18-22 درجه سلسیوس به مدت حداکثر سه ماه نگه داری نمود. در آزمایشگاه آب و پساب محیط هایی که تحت شرایط سترونی تقسیم و توزیع  می شوند را می توان در دمای 4-10 درجه سلسیوس حداکثر به مدت یک ماه نگهداری نمود. کلیه محیط های کشت باید قبل از مصرف از نظر آلودگی، تبخیر زیاد و یا سایر نشانه های فستاد کنترل شوند.

روش کار

 با رعایت شرایا سترونی حجم معین نمونه آب را به لوله های حاوی محیط مایع تلقیح کنید.

روش های متداو MPN 3 یا 5 لوله ای  است. برای مثال  اگر 3 سری 3 تایی لوله در نظر گرفته شود . به سری مضاعف محیط کشت 10 میلی لیترنمونه ، به سری اول  محیط کشت معمولی 1 میلی لیتر و به سری دوم محیط کشت معمولی 1/0 میلی لیتر نمونه اضافه می شود .

برای سنجش کلیه کلیفرم از یک محیط کشت عمومی مانند لاکتوز براث دردمای محیط 35-37 درجه استفاده می گردد. جهت تایید این مرحله به تعداد لوله های آزمایش مثبت می توان از لوله های حاوی محیط کشت بریلینت گرین استفاده نمود. 

برای سنجش فکال کلیفرم از یک محیط کشت اختصاصی مانند محیط کشت آمادهEC  مدیوم دردمای محیط 44-45 درجه استفاده می گردد. مواد موجود در محیط کشت اختصاصی و دمای مذکور مشابه مواد و دمای موجود در روده بزرگ است باکتریهای کلیفرمهای گوارشتی خود را با آن سازگار نموده و توان رشد در این شرایط را دارند.( شرایطی که باکتریهای غیر روده ای اکثرا" قادر به رشد نیستند).

برای تایید وجود کلیفرم ها توسط حلقه کشت ( قطر حلقه 3 میلی متر) یک حلقه کامل یا با پیپت سترون یک قطره از هر از لوله های حاوی لاکتوز براث واکنش مثبت برداشت نموده و به لوله های حاوی محیط آبگوشت بریلینت گرین brilliant green broth تلقیح گردد . لوله ها در دمای 35 تا 37 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری نموده و پس از 48 ساعت از نظر تولید گاز بررسی شود . 

 برای تایید  اشریشیاکلی،  توسا حلقه کشت از لوله های حاوی EC  برای واکنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آب تریپتونه Tryptone water  تلقیح گردد. سپس لوله ها به مدت 24 ساعت در دمای 44 درجه سلسیوس قرار گیرد . پس از پایان این مدت مقدار 5 /0 سی سی از معرف کواکس به لوله ها اضافه شود . پس از یک دقیقه تکان دادن لوله ها ، ایجاد رنگ قرمز دلیل بر حضور اندول  است و واکنش از نظر وجود اشریشیاکلی مثبت می باشد.

محاسبه

شمارش کلی فرم ها بر اساس تولید گاز و جمع شدن آن در لوله های درهام می باشد روش های MPN 3 یا 5 لوله ای را درصورت مثبت بودن می توان با جدول نتایج مقایسه نموده و در 100 میلی لیتر نتیجه را گزارش نمایید. در صورتی که نمونه مورد آزمون رقیق می شود تنها از سه حجم متوالی برای محاسبه محتمل ترین تعداد استفاده می گردد به منظور تخمین تعداد میکروارگانیسم ها در حجم مرجع (برای مثا 100 میلی لیتر) تعداد بدست آمده از جدول را در ضریب رقت مورد استفاده ضرب کنید.   محیط کشتهای آلوده پس از بررسی توسط اتوکتلاو در دمای 121 درجته سانتی گراد و  فشار یک اتمسفر استریل و سپس دور ریخته می شود.  

کالیبراسیون

با توجه به این مهم که یکی ازاساسی ترین پارامترهای موثر در دستیابی به پاسخ صحیح در آزمایشات صحت، دقت و عملکرد صحیح دستگاهها می باشد بررسی این موارد یکی از وظایف اصلی شخص آزمایشگر را تشکیل می دهد. در آزمایشگاه بیولوژی دستگاهای مورد استفاده در سیکل آنتالیز از مرحله تهیه محیط کشت، گرمخانه گذاری و استریل همگی نیازمند کالیبراسیون دمایی(بن ماری، انکوباتور و ....) ، دما و فشار  (اتوکلاو)  و جرمی  (ترازو) می باشند که برای انجام آن پس از تعیین دما و بازه زمانی مورد نظر که کاملا  بسته به حجم کاری و نظر کارشناس متغییر است ، میتوان از مراکز و مراجع  ذیصلاح جهت کالیبراسیون دعوت به همکاری نمود. در خصوص دستگاه اتوکلاو بغیر از بررسی دما وگیج فشار یکی از روشهای دیگربررسی صحت عملکرد استفاده از Sterikon plus Bioindicator  است. این محصول ، آمپولی است که متشکل از آبگوشت مغذی،شکر، نشانگرpH،میکروب های غیر بیماری زا وGeobacillus  Stearothermophilus   می باشد. مقاومت گرمایی این گونه، به نوعی است که پس از 15 دقیقه دمای 121 درجه ستانتیگراد بطورکامل کشته می شود. در صورت انجام کامل سیکل استریل میکروب ها بطور کامل کشته شده ومحتویات آمپول  به رنگ ارغوانی شفاف (بنفش) در  می آید در غیر اینصورت رنگ آمپول  به رنگ زرد- نارنجی می باشدکه علت آن تخمیر و جوشش شکر است که بر اثر رشد میکروبی غلیظ شده است.